李鴻章出任兩淮鹽運使的美夢沒有實現，太平軍為了挽救安慶，他們對上游的湘軍發動了聲勢浩大的鉗形攻勢，分兵南北兩路，沿江西上，「合取湖北」，準備在武漢會師。這次攻勢確實打中了曾國藩的要害。因為當時在安慶及其周圍地區集結了曾國藩的湘軍主力，以武漢為中心的湖北防務非常空虛。然而湖北卻是湘軍的戰略基地，武漢尤為全局根本。太平軍「合取湖北」，把戰火引向敵人後方，避敵主力，打其虛弱，攻其必救，既可解安慶之圍，又能殲滅湘軍主力。太平軍的這一策略讓曾國藩膽戰心驚，他立即採取應變之策，決意不撤皖圍之兵以援鄂，反而督軍猛攻安慶，企圖迫使太平軍盡快地從上游回顧下游，並進行決戰。他把所謂旋轉乾坤的賭注，全押在安慶圍點打援上面了。南路西征太平軍路經皖南時，曾經攻佔寧國、徽州等地，並「環繞祁門作大圍包抄之勢」，致使坐困祁門的曾國藩「日在驚濤駭浪之中」。
這時曾國藩除了招致太平軍的環攻外，還遇到北上「勤王」和祁門內訌兩個棘手的問題。一八五六年，英法聯軍發動侵華戰爭，即第二次鴉片戰爭。一八六○年九月，英法聯軍攻佔天津，直逼北京城下。咸豐皇帝在逃往熱河途中命孤駐祁門的曾國藩派湘軍精銳鮑超部北上救援。接到命令後，曾國藩左右為難，舉棋不定。因為北上「勤王」責無旁貸，無可推諉，但他又想留下鮑超所部對抗太平軍；如不北上護主，將被責為天下罪人。但此時正是剿殺太平軍的關鍵時刻，一旦抽掉精銳，於戰局大有影響，而且這時正值徽州失守、祁門危急之時。曾國藩急得幾個晚上不能入眠，於是令下屬每人提一種方案，結果幾乎都主張北上「勤王」，但只有李鴻章力排眾議，不同意調兵北上。李鴻章認為英法聯軍已在北京城下，破城而入只是朝夕之事，調兵北上保衛京城已毫無意義；而且英法聯軍侵略最終將「金帛議和」了事，危及大清社稷的不是英法聯軍，而是造反的太平軍。
李鴻章比清政府更早看出這一點，眼光確非尋常。他進一步論述湘軍鎮壓太平軍是關係「天下安危」之事，對北上馳援應「按兵請旨」，靜觀局勢變化。經過仔細權衡，曾認為李說的確有道理，於是採用此議。他上疏朝廷表示願意北上，但提出鮑超人生地不熟「斷不能至」，所以請朝廷在胡林翼和自己之間「酌派一人進京護衛根本」，其實是在拖延時間，因為往返奏報大約需要一個月的時間。果然不出所料，不久就接到「和議」已成，不必北援的命令。此事使曾國藩對李鴻章更加器重。李鴻章對曾國藩雖以師相待，但他畢竟是極有主見之人，經常因固執己見而時有衝突，李鴻章有幾次想離曾國藩而去。一八六○年，曾國藩升任兩江總督，並決定將大營遷往安徽祁門時，李鴻章認為祁門地勢如同「釜底」，沒有進退餘地，從戰略上看，移營至此十分危險。在太平軍攻擊下，的確險情不斷，李鴻章等人一再要求移師他處。而曾國藩堅持己見，甚至對李鴻章等人說：「諸君如膽怯，可各散去」。
不久，雙方又因李元度事件矛盾再起，更加尖銳，終導致李鴻章負氣出走。李元度（字次青）是曾國藩「辛苦久從之將」，曾國藩在靖港、九江和樟樹鎮敗績後的艱難歲月中，曾經得到李元度的有力支持。曾國藩自稱與李元度的「情誼之厚始終不渝」。李元度擅長文學而不知兵，只因曾國藩私情薦舉，才升任徽寧池太廣道，領兵駐防徽州。當太平軍李侍賢部來攻時，李元度違反曾國藩堅壁自守的指令，出城接仗，一觸即潰，徽州易手。李元度徘徊浙贛邊境，經久不歸，後來雖然回到祁門，但不久又私自離去。曾國藩悔恨交加，決定具疏劾之，以申軍紀。曾國藩此舉本來無可厚非，但文武參佐卻群起反對，指責他忘恩負義。李鴻章「乃率一幕人往爭」，聲稱「果必奏劾，門生不敢擬稿。」曾國藩說：「我自屬稿」。李鴻章表示：「若此則門生亦將告辭，不能留侍矣。」曾國藩生氣地說：「聽君之便」。十月二十五日，曾國藩在日記中寫道：「日內因徽州之敗，深惡次青，而又見同人多不明大義，不達事理，抑鬱不平，遂不能作一事。」從曾國藩手書日記原稿看，曾國藩在「而」與「又見」之間圈掉「少荃」二字，他的原意可能要寫「少荃不明大義，不達事理」。其實，曾國藩對李鴻章的批評是切中要害的。李鴻章鑒於自己意見被拒和祁門奇險萬狀形勢，便憤然辭幕，離開祁門，打算返回南昌哥哥家中。